2013年初級檢驗技師考試：HLA細胞法分型試驗

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　　HLA-D和DP位點的抗原須用細胞法分型進行鑒定，所以又稱LD抗原(lymphocytedefinedantigen)，其鑒定方法普遍采用混合淋巴細胞培養(yǎng)(mixedlymphocyteculture，MLC)，也稱混合淋巴細胞反應(mixedlymphocytereaction，MLR)。

　　1.試驗方法將分離的反應細胞(通常是患者的淋巴細胞)與刺激細胞(通常是供者或已知的標準淋巴細胞)配制成1×106/ml濃度的懸液，各加 0.2ml到反應管中;放置37℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)5～6天。培養(yǎng)結束后進行涂片染色，觀察并計數轉化的淋巴細胞;也可在培養(yǎng)結束前5～12小時加入3H-TdR，收獲后用液體閃爍儀計數細胞的放射性。試驗結果的常用表示方式是刺激指數(SI)。

　　MLC分為雙向法和單向法。雙向MLC是反應管中兩種細胞都有應答能力，可以互為刺激細胞和反應細胞，試驗結果是兩種細胞反應之和。

　　SI=2×試驗管cpm/(A對照cpm+B對照cpm)

　　雙向MLC只能反映兩種細胞間LD的差別，結果比較模糊，也不能做LD抗原的分型。單向MLC是將刺激細胞用絲裂霉素 C(mitomycinC)或X線照射先行滅活，但細胞的抗原性保持不變，因此可作為刺激細胞而不能作為反應細胞，試驗結果是待檢測細胞的反應，使于結果分析。

　　SI=試驗管cpm/自身對照cpm

　　單向MLC可以用來進行HLD-D和DP位點的分型試驗，常用的方法有兩類：純合子分型細胞(homozygoustypingcell，HTC)試驗和預敏淋巴細胞分型(primedlymphocytetyping，PLT)試驗。

　　2.HTC試驗HTC是指細胞內一對同源染色體上兩個HLA單倍型完全相同，所以該位點在細胞表面只表達一種抗原;HTC可從近親婚配的子代表中尋找。將一組HTC經處理來活后作為刺激細胞，與待檢細胞做單向MLC。如果待檢細胞與刺激細胞的LD不同，就會發(fā)生反應;如果相同便不反應;所以試驗又稱為陰性分型法。當SI≤2時可認為待檢細胞與該管HTC的LD抗原相同。本法的缺點是HTC難以得到，而且培養(yǎng)時間長(5～6天)，在尸體器官移植時不能應用。

　　3.PLT試驗本方法需事先準備分型細胞：選擇只有一個單倍型相同的兩個體a/b和a/c(這在雙親與子女之間不難做到)，取前者的淋巴細胞處理后作刺激細胞，取后者的淋巴細胞作反應細胞;將兩者進行單向混合培養(yǎng)，至第10天使可得到針對b單倍型有特異性免疫應答能力的預致敏分型細胞(PTL)。依此類推，可以制備出一系列能識別各種已知LD抗原的一套PTL;這些處于休止狀態(tài)的致敏記憶細胞可在液氮中長期保存?zhèn)溆谩?/P>

　　進行PLT試驗時，需將待檢淋巴細胞處理成刺激細胞，而PTL為反應細胞;如果待檢細胞的LD抗原與PTL預先識別的特異性相同，則PTL會迅速出現(xiàn)反應(二次應答)，如不同則不出現(xiàn)快速反應，所以本法又稱為陽性分型法。PLT法克服了HTC法試驗周期長的缺點，在24小時內即可報出結果;PTL比HTC容易得到，但真正做起來也復雜。

　　不管是CDC試驗還是MIC方法，都必須以受檢者的淋巴細胞作為檢測標本，這就大大地限制了檢測方法的應用范圍;而且還存在抗體來源困難、細胞培養(yǎng)周期過長等缺點;所以近年來將分子生物學技術引入了HLA檢測的領域，產生了DNA分型法。DNA分型法是利用PCR技術將標本中的少量目的DNA大量擴增，然后再進行產物鑒定的方法(原理和步驟在此不予討論)，特點是靈敏度高，試劑來源容易，應用范圍廣，陳舊的或微量的標本都可進行檢測，在移植醫(yī)學、法醫(yī)學和其他方面都有廣闊的前途。

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